L’ADN environnemental

Cette technique est particulièrement avantageuse pour les espèces aquatiques et semi-aquatiques puisque l’ADN relâché par les organismes cibles est transporté par les milieux aquatiques, ce qui améliore la capacité de détecter les espèces d’intérêt.

Les résultats d’analyse d’ADNe permettent de prendre des décisions plus éclairées pour tout ce qui concerne la santé et la biodiversité des écosystèmes. Les méthodes traditionnelles sont souvent moins sensibles et plus laborieuses et elles demandent une main-d’œuvre plus importante. Elles sont aussi sujettes à des biais des analystes et leur capacité à confirmer la répartition des espèces cryptiques ou peu abondantes est limitée.

Les avantages de l’ADN environnemental

Les analyses d’ADNe offrent donc plusieurs avantages lorsqu’on les compare aux méthodes traditionnelles :

• Elles sont plus sensibles   ; il est possible de détecter une espèce cible cryptique ou présente en petit nombre avec une meilleure puissance de détection que les méthodes d’enquêtes traditionnelles.
• Elles prennent moins de temps ; l’échantillonnage prend généralement moins de temps comparé aux méthodes d’enquête traditionnelles.
• Elles sont rentables ; il est possible d’analyser plusieurs espèces cibles à partir d’un seul échantillon.
• Elles sont moins envahissantes  ; pas besoin d’utiliser des techniques de capture telles que le piégeage ou la pêche à l’électricité; les effets sur les habitats sensibles sont donc moindres et les risques de transfert d’agents pathogènes sont aussi moins importants.
• Elles ne nécessitent pas de permis ou de licence  ; il est possible d’échantillonner l’eau pour l’ADNe sans qu’il soit nécessaire de capturer, de manipuler ou même d’observer l’espèce cible.
• Elles réduisent les erreurs liées au biais de l’analyste   ; l’échantillonnage environnemental de l’ADNe réduit les erreurs associées à l’expérience de l’observateur ou de l’observatrice, aux variations dans les efforts d’enquête ou aux conditions de terrain.
• Elles améliorent la sécurité sur le terrain  ; l’échantillonnage peut se faire de jour et dans des conditions météorologiques favorables.
• Elles sont plus précises  ; les analyses d’ADNe bien conçues sont spécifiques à l’espèce cible et ne nécessitent pas l’intervention d’un expert ou d’une experte pour identifier l’espèce en question.
• Elles permettent la rétroaction ; des échantillons bien conservés et archivés peuvent être analysés à une date ultérieure pour d’autres espèces d’intérêt.
• Elles élargissent les possibilités d’enquête ; l’échantillonnage de l’ADNe peut être réalisé en dehors des limites conventionnelles, par exemple en dehors de la période de reproduction des amphibiens.

Protocoles d’analyse pour l’ADN environnemental

Il existe plusieurs méthodes de détection de l’ADNe. La majorité d’entre elles font appel à une réaction en chaîne de polymérase quantitative (RCPq), aussi connue sous le nom RCP en temps réel, pour détecter la présence d’espèces cibles. Il s’agit d’une analyse d’ADN sensible et précise capable de détecter de faibles quantités d’ADN par des cycles de RCP qui génèrent de façon exponentielle de nombreuses copies d’ADN qui sont ensuite analysées par l’instrument de laboratoire à l’aide d’un colorant rapporteur fluorescent.

Considérant le fait que l’ADN est souvent présent en petite quantité, qu’il est soumis aux variations dans l’environnement et qu’il est rejeté à des taux variables d’un organisme à l’autre, les résultats d’analyses d’ADNe sont présentés sous forme qualitative (« détecté » ou « non détecté »), plutôt que quantitative.

Bureau Veritas a obtenu un permis pour l’utilisation du protocole d’ADNe développé par le Dr Caren Helbing de la University of Victoria. Ce protocole (figure 1) considère, en première étape, l’échantillonnage d’eau suivi de la filtration et de la conservation de l’échantillon. La deuxième étape est l’extraction d’ADNe contenu dans l’échantillon prélevé. La troisième étape du protocole est le contrôle qualité de l’ADNe extrait par RCP quantitative dans IntegritE-DNA. L’objectif est de détecter l’absence d’inhibiteur, puis la présence d’ADN amplifiable, une démarche essentielle pour prévenir les faux résultats négatifs.

Figure 1 : Protocole d’ADNe à Bureau Veritas

1. Échantillonnage, filtration et conservation
Image	Pour garantir la qualité de la récupération, la filtration et la conservation des échantillons d’ADNe (dans la silice ou dans de l’éthanol de qualité moléculaire à 95 - 100%) doivent être réalisées dans les 24 h suivant l’échantillonnage.
2. Extration de l’ADNe
Image	Un quart du filtre est extrait pour l’analyse d’ADNe. Ce qui reste peut être archivé pour de futures analyses d’ADNe.
3. Contrôle de la qualité de l’ADNe
Image	Le IntegritE-DNA™ de l’ échantillon de contrôle de la qualité pour l’ADN est rempli avant l’analyse pour les espèces cibles. Seul les échantillons d’ADNe qui amplifient avec succès le IntegritE-DNA™ sont gardés dans le processus d’analyse pour les espèces cibles. le risque de faux négatifs est ainsi minimisé, ces derniers étant causés par la mauvaise qualité de l’ADN ou l’inhibition de la réaction en chaîne de polymérase quantitative (ou RCPq).
4. RCPq pour les espèces cibles
Image	L’analyse d’ADNe détecte des espèces cibles. Idéalement, la méthode utilisée cible une seule espèce, mais dans certains cas (ex. eFish) elle considère plusieurs espèces (voir tableau 1). Huit réplicats sont analysés pour chaque échantillon à des fins statistiques.

La quatrième et dernière étape consiste en un essai par RCP quantitative dans eTarget pour confirmer la présence d’ADN des espèces cibles. Huit réplicats sont analysés pour chaque échantillon afin de fournir une puissance statistique suffisante pour confirmer que l’ADN de l’espèce cible a été « détecté » ou « non détecté ». Des témoins positifs sont intégrés à cette méthode pour s’assurer que les analyses donnent des résultats justes et fiables.

Le volume d’ADNe extrait est suffisant pour quatre ou cinq essais par RCP quantitative dans eTarget dans les cas où il était nécessaire d’analyser la présence de plusieurs espèces à partir du même échantillon.

Échantillonnage

Considérant la diversité des espèces cibles et de leur habitat, les méthodes de prélèvement, de filtration, de conservation et de traitement des échantillons varient aussi considérablement (figure 2).

Figure 2 : Parcours des échantillons

1. Prélèvement des échantillons d’eau	2. Filtration des échantillons d’eau	3. Préparation du filtre	4. Conservation au silice
Image	Image	Image	Image

Pour maximiser les taux de détection, il est primordial de bien préparer le plan d’expérimentation pour que le protocole de prélèvement sur le terrain soit efficace.

Il est recommandé de revoir les commentaires présentés dans le document Environmental DNA Protocol for Freshwater Aquatic Ecosystems, version 2.2 [2] (le protocole sur l’ADN environnemental pour les écosystèmes aquatiques d’eau douce, traduction libre) et de consulter un spécialiste ou une spécialiste en environnement et ADNe.

La conservation de l’échantillon d’ADNe est importante pour assurer la réussite des analyses en laboratoire. En général, les échantillons d’eau doivent être filtrés, conservés et entreposés dans de l’éthanol de qualité moléculaire de 95 à 100 % ou dans de la silice dans les 24 heures suivant l’échantillonnage (et avant d’être soumis au laboratoire). Une fois les échantillons conservés et entreposés, les filtres d’ADN devraient restés viables pendant six mois ou plus longtemps s’ils sont entreposés dans des congélateurs sans dégivrage automatique à - 20 °C ou moins. L’ADNe extrait en laboratoire (dans une solution tampon) est très stable et demeurera viable pendant des années dans ces mêmes conditions d’entreposage (dans un congélateur).

Éléments à prendre en compte pour les analyses d’ADN environnemental

Pour assurer l’efficacité de l’analyse d’ADNe, il faut tenir compte des éléments qui suivent :

Plan d’échantillonnage sur le terrain

• Le meilleur moment pour échantillonner
• Le meilleur endroit où échantillonner
• La quantité d’échantillons, dans le temps et dans l’espace

Filtration et conservation des échantillons

• Les échantillons d’eau doivent être filtrés le plus rapidement possible, soit les 24 heures suivant le prélèvement.
• Le filtre (l’échantillon) doit être conservé dans de l’éthanol de qualité moléculaire de 95 à 100 % ou de la silice immédiatement après la filtration.

Analyse d’ADNe

• À des fins de spécificité, la validation des essais d’ADNe doit permettre de vérifier que seules les espèces cibles ont été détectées.
• Le protocole de laboratoire comprend des mécanismes de surveillance de la dégradation de l’ADN et de l’inhibition du test.
• La quantité de réplicats dans le laboratoire augmente la puissance statistique (Bureau Veritas teste huit réplicats par échantillon).

Analyses d’ADN environnemental offertes

Les analyses d’ADNe offertes sont présentées au tableau 1. Elles ciblent toutes une espèce en particulier, sauf le test eFish. Ce dernier est général et il permet d’identifier l’ADNe de 19 espèces de poisson, mais ne permet pas de différencier ces espèces entre elles.

Tableau 1 : Analyses d’ADNe offertes

	TESTS D’ADNe	ESPÈCE	NOM COMMUN
Poissons	ANRO	Anguilla rostrata	Anguille d’Amérique
Poissons	CAAU	Carassius auratus	Poisson rouge
Poissons	CACA	Catostomus catostomus	Meunier de Salish
Poissons	ESLU	Esox lucius	Brochet
Poissons	ESNI	Esox niger	Brochet maillé
Poissons	HYPR	Hypomesus pretiosus	Éperlan argenté
Poissons	MIDO	Micropterus dolomieu	Achigan à petite bouche
Poissons	MISA	Micropterus salmoides	Achigan à grande bouche
Poissons	ONCL	Oncorhynchus clarkii	Truite fardée
Poissons	ONGO	Oncorhynchus gorbuscha	Saumon rose
Poissons	ONKI	Oncorhynchus kisutch	Saumon coho
Poissons	ONMY	Oncorhynchus mykiss	Truite arc-en-ciel (steelhead)
Poissons	ONNE	Oncorhynchus nerka	Saumon rouge
Poissons	ONTS	Oncorhynchus tshawytscha	Saumon quinnat
Poissons	RHUM	Rhinichthys umatilla	Naseux d’Umatilla
Poissons	SACO	Salvelinus confluentus	Omble à tête plate
Poissons	THAR	Thymallus arcticus	Ombre arctique
Poissons	THPA	Thaleichthys pacificus	Eulakane
Poissons	eFish*	Oncorhynchus nerka (ONNE)	Saumon rouge
Poissons	eFish*	Oncorhynchus gorbuscha (ONGO)	Saumon rose
Poissons	eFish*	Oncorhynchus keta (ONKE)	Saumon kéta
Poissons	eFish*	Thymallus arcticus (THAR)	Ombre arctique
Poissons	eFish*	Oncorhynchus clarkii (ONCL)	Truite fardée
Poissons	eFish*	Oncorhynchus mykiss (ONMY)	Truite arc-en-ciel
Poissons	eFish*	Oncorhynchus tshawytscha (ONTS)	Saumon quinnat
Poissons	eFish*	Oncorhynchus kisutch (ONKI)	Saumon coho
Poissons	eFish*	Salmo salar (SASA)	Saumon atlantique
Poissons	eFish*	Salvelinus malma (SAMA)	Crabe à pois (Dolly Varden)
Poissons	eFish*	Prosopium cylindraceum (PRCY)	Ménomini rond
Poissons	eFish*	Cottus cognatus (COCO)	Chabot visqueux
Poissons	eFish*	Anguilla rostrata (ANRO)	Anguille d’Amérique
Poissons	eFish*	Esox lucius (ESLU)	Brochet
Poissons	eFish*	Gasterosteus aculeatus	Épinoche à trois épines
Poissons	eFish*	Micropterus salmoides (MISA)	Achigan à grande bouche
Poissons	eFish*	Salvelinus confluentus (SACO)	Omble à tête plate
Poissons	eFish*	Micropterus dolomieu (MIDO)	Achigan à petite bouche
Poissons	eFish*	Thaleichthys pacificus (THPA)	Eulakane
Grenouilles	ANBO	Anaxyrus (Bufo) boreas	Crapaud de l’Ouest
Grenouilles	ASMO	Ascaphus montanus	Grenouille à queue des Rocheuses
Grenouilles	ASTR	Ascaphus truei	Grenouille-à-queue côtière
Grenouilles	LICA	Lithobates (Rana) catesbeiana	Ouaouaron de l’Amérique du Nord
Grenouilles	LIPI	Lithobates (Rana) pipiens	Grenouille léopard
Grenouilles	RAAU	Rana aurora	Grenouille à pattes rouges
Grenouilles	RACA	Rana cascadae	Grenouille des Cascades
Grenouilles	RALU	Rana luteiventris	Grenouille maculée de Columbia
Grenouilles	RAPR	Rana pretiosa	Grenouille maculée de l’Oregon
Grenouilles	SPIN	Spea intermontana	Crapaud pied-bêche du Grand Bassin
Autres	AMMV (AMTI)	Ambystoma mavortium	Salamandre tigrée de l’Ouest
Autres	AMMV (AMTI)	Ambystoma tigrinum	Salamandre tigrée
Autres	COTE	Contia tenuis	Couleuvre à queue fine
Autres	GLIN	Glyptemys insculpta	Tortue des bois
Autres	SOBE	Sorex bendirii	Musaraigne de Bendire

*Le test eFish est conçu pour être non spécifique. Il peut détecter l'ADNe d'autres espèces de poissons en plus ou à la place des espèces spécifiques énumérées ici, pour lesquelles le test a été validé. Il est important de noter que dans le but de concevoir un test d’ADNe pour détecter la présence de toute espèce de poisson, le test détecte également la présence de certaines espèces d'amphibiens.

Élaboration de méthodes d’analyse de l’ADN environnemental

À ce jour, l’approche de Bureau Veritas concernant le développement de méthodes d’essais pour l’ADNe à des fins commerciales est de valider, à l’interne, des méthodes déjà publiées. Ainsi, les essais sont transférables pour les échantillons contrôlés en laboratoire ou qui proviennent du site pour deux paramètres fondamentaux : la sensibilité (des critères de détection fiables) et la spécificité (aucune réaction croisée, surtout pour les espèces apparentées ou sympatriques). Grâce aux commentaires des clients, Bureau Veritas continuera d’élargir la gamme de méthodes d’essais commerciaux d’ADNe telles que présentées au tableau 1.

Il convient toutefois de noter que l’approche ci-dessus laisse une question importante sans réponse : que faire pour les espèces cibles pour lesquelles aucun test d’ADNe n’a encore été mis au point à ce jour ?

La disponibilité future de données sur les séquences d’ADN pour d’autres espèces permettra sans aucun doute de concevoir des amorces et des sondes. L’accessibilité à des échantillons de tissus (ou ADN génomique) des espèces cibles (et des espèces apparentées ou sympatriques) est une condition préalable à la conception d’un plan d’expérimen-tation. Cette condition pose problème lorsque la population des espèces cibles est en faible quantité, rare ou en voie de disparition et que leur échantillonnage pourrait donc être interdit. Bureau Veritas compte conclure des ententes collaboratives avec des tierces parties qui faciliteraient le développement de nouveaux tests d’ADNe pour les espèces cibles d’intérêt.

Limites des analyses d’ADNe

Les limites des tests d’ADNe doivent être prises en considération lors de la conception d’études sur le terrain et de l’interprétation des résultats en laboratoire :

• Les résultats sont binaires ; l’analyse d’ADNe donne un résultat « détecté » ou « non détecté ». Les résultats ne peuvent être extrapolés pour déterminer l’abondance ou la densité des espèces cibles.
• Les renseignements géographiques sont limités; Puisque l’ADN est transporté dans les milieux aquatiques, il est impossible d’en extraire des données exactes sur la localisation ou la proximité de l’organisme ou encore sur la durée de sa présence dans l’environnement.
• L’ADNe ne permet pas de confirmer la présence d’un organisme vivant ou mort, mais plutôt de détecter des signes de présence des espèces cibles.
• La source précise de l’ADN sur l’organisme (p. ex. les gamètes ou la peau) n’est pas révélée par l’ADNe.
• Les résultats sont limités à « détecté » et « non détecté ». L’âge, le sexe, la grosseur et l’état reproducteur des organismes par exemple ne sont pas détectés.
• Les tests d’ADNe sont influencés par les variations du milieu qui affectent le transport de l’ADN (comme le débit de l’eau) et sa stabilité (température de l’eau, pH, salinité, exposition aux microorganismes, à la lumière ultraviolette qui dégradent l’ADN). En général, l’ADNe peut être détecté de 7 à 21 jours après son rejet dans l’environnement.

Et maintenant ?

L’analyse de l’ADNe devient une technique fiable et solide qui s’ajoute aux autres méthodes de surveillance traditionnelles de l’environnement. Il est important de noter que les techniques traditionnelles offrent encore des avantages sélectifs par rapport à celle de l’ADNe, dont la possibilité de faire la distinction entre plusieurs espèces vivantes et les différentes étapes du cycle de vie de ces dernières.

De plus, les normes d’analyse de l’ADNe pour les laboratoires ne sont pas encore établies et elles doivent être soigneusement étudiées pour que cette technique en constante évolution puisse être utilisée au maximum de sa capacité.

Bureau Veritas s’engage à travailler étroitement avec les experts et expertes en analyse d’ADNe pour élaborer des normes qui sont à la fois appropriées et acceptées puisqu’elles deviendront la pierre angulaire de la qualité des résultats et de son acceptation générale.

Bureau Veritas est fier d’être le premier laboratoire canadien en analyse de l’ADNe à recevoir une certification ISO/CEI 17025 par le Conseil canadien des normes. Nous nous engageons à travailler étroitement avec les experts et expertes en analyse d’ADNe pour élaborer des normes par processus consensuel qui permettront une meilleure interprétation des résultats.

Références

[1] Veldhoen N, Hobbs J, Ikonomou G, Hii M, Lesperance M. et Helbing CC. Implementation of Novel Design Features for qPCR-Based eDNA Assessment. PLoS One, 2016, 11 :11, e0164907. Publié le 1er novembre 2016 DOI:10.1371/journal.pone.0164907

[2] Jared Hobbs et Caren Goldberg. Environmental DNA Protocol for Freshwater Aquatic Ecosystems (version 2.2), préparé pour : le ministère de l’Environnement de la Colombie-Britannique, novembre 2017.