Laboratoire

L’ADN environnemental

jan. 28 2019

L’analyse d’ADN environnemental (ADNe) est un outil scientifique utilisé pour améliorer ou même remplacer les méthodes traditionnelles d’enquêtes écologiques servant à détecter les espèces d’intérêt. L’ADNe fait référence au matériel génétique (ADN nucléaire et mitochondrial) relâché par les organismes dans leur environnement, comme les gamètes, les cellules mortes de la peau, les excréments, l’urine, le mucus, etc., et qui peut être échantillonné dans l’eau ou le sol.

Cette technique est particulièrement avantageuse pour les espèces aquatiques et semi-aquatiques puisque l’ADN relâché par les organismes cibles est transporté par les milieux aquatiques, ce qui améliore la capacité de détecter les espèces d’intérêt.

Les résultats d’analyse d’ADNe permettent de prendre des décisions plus éclairées pour tout ce qui concerne la santé et la biodiversité des écosystèmes. Les méthodes traditionnelles sont souvent moins sensibles et plus laborieuses et elles demandent une main-d’œuvre plus importante. Elles sont aussi sujettes à des biais des analystes et leur capacité à confirmer la répartition des espèces cryptiques ou peu abondantes est limitée.

Les avantages de l’ADN environnemental

Les analyses d’ADNe offrent donc plusieurs avantages lorsqu’on les compare aux méthodes traditionnelles :

  • Elles sont plus sensibles   ; il est possible de détecter une espèce cible cryptique ou présente en petit nombre avec une meilleure puissance de détection que les méthodes d’enquêtes traditionnelles.
  • Elles prennent moins de temps ; l’échantillonnage prend généralement moins de temps comparé aux méthodes d’enquête traditionnelles.
  • Elles sont rentables ; il est possible d’analyser plusieurs espèces cibles à partir d’un seul échantillon.
  • Elles sont moins envahissantes  ; pas besoin d’utiliser des techniques de capture telles que le piégeage ou la pêche à l’électricité; les effets sur les habitats sensibles sont donc moindres et les risques de transfert d’agents pathogènes sont aussi moins importants.
  • Elles ne nécessitent pas de permis ou de licence  ; il est possible d’échantillonner l’eau pour l’ADNe sans qu’il soit nécessaire de capturer, de manipuler ou même d’observer l’espèce cible.
  • Elles réduisent les erreurs liées au biais de l’analyste   ; l’échantillonnage environnemental de l’ADNe réduit les erreurs associées à l’expérience de l’observateur ou de l’observatrice, aux variations dans les efforts d’enquête ou aux conditions de terrain.
  • Elles améliorent la sécurité sur le terrain  ; l’échantillonnage peut se faire de jour et dans des conditions météorologiques favorables.
  • Elles sont plus précises  ; les analyses d’ADNe bien conçues sont spécifiques à l’espèce cible et ne nécessitent pas l’intervention d’un expert ou d’une experte pour identifier l’espèce en question.
  • Elles permettent la rétroaction ; des échantillons bien conservés et archivés peuvent être analysés à une date ultérieure pour d’autres espèces d’intérêt.
  • Elles élargissent les possibilités d’enquête ; l’échantillonnage de l’ADNe peut être réalisé en dehors des limites conventionnelles, par exemple en dehors de la période de reproduction des amphibiens.

Protocoles d’analyse pour l’ADN environnemental

Il existe plusieurs méthodes de détection de l’ADNe. La majorité d’entre elles font appel à une réaction en chaîne de polymérase quantitative (RCPq), aussi connue sous le nom RCP en temps réel, pour détecter la présence d’espèces cibles. Il s’agit d’une analyse d’ADN sensible et précise capable de détecter de faibles quantités d’ADN par des cycles de RCP qui génèrent de façon exponentielle de nombreuses copies d’ADN qui sont ensuite analysées par l’instrument de laboratoire à l’aide d’un colorant rapporteur fluorescent.

Considérant le fait que l’ADN est souvent présent en petite quantité, qu’il est soumis aux variations dans l’environnement et qu’il est rejeté à des taux variables d’un organisme à l’autre, les résultats d’analyses d’ADNe sont présentés sous forme qualitative (« détecté » ou « non détecté »), plutôt que quantitative.

Bureau Veritas a obtenu un permis pour l’utilisation du protocole d’ADNe développé par le Dr Caren Helbing de la University of Victoria. Ce protocole (figure 1) considère, en première étape, l’échantillonnage d’eau suivi de la filtration et de la conservation de l’échantillon. La deuxième étape est l’extraction d’ADNe contenu dans l’échantillon prélevé. La troisième étape du protocole est le contrôle qualité de l’ADNe extrait par RCP quantitative dans IntegritE-DNA. L’objectif est de détecter l’absence d’inhibiteur, puis la présence d’ADN amplifiable, une démarche essentielle pour prévenir les faux résultats négatifs.

Figure 1 : Protocole d’ADNe à Bureau Veritas

Protocole d’ADNe


La quatrième et dernière étape consiste en un essai par RCP quantitative dans eTarget pour confirmer la présence d’ADN des espèces cibles. Huit réplicats sont analysés pour chaque échantillon afin de fournir une puissance statistique suffisante pour confirmer que l’ADN de l’espèce cible a été « détecté » ou « non détecté ». Des témoins positifs sont intégrés à cette méthode pour s’assurer que les analyses donnent des résultats justes et fiables.

Le volume d’ADNe extrait est suffisant pour quatre ou cinq essais par RCP quantitative dans eTarget dans les cas où il était nécessaire d’analyser la présence de plusieurs espèces à partir du même échantillon.

Échantillonnage

Considérant la diversité des espèces cibles et de leur habitat, les méthodes de prélèvement, de filtration, de conservation et de traitement des échantillons varient aussi considérablement (figure 2).

Figure 2 : Parcours des échantillons

1. Prélèvement des échantillons d’eau 2. Filtration des échantillons d’eau 3. Préparation du filtre 4. Conservation au silice
Water sample collection
Water filtration
Filter preparation
Filter preservation

Pour maximiser les taux de détection, il est primordial de bien préparer le plan d’expérimentation pour que le protocole de prélèvement sur le terrain soit efficace.

Il est recommandé de revoir les commentaires présentés dans le document Environmental DNA Protocol for Freshwater Aquatic Ecosystems, version 2.2 [2] (le protocole sur l’ADN environnemental pour les écosystèmes aquatiques d’eau douce, traduction libre) et de consulter un spécialiste ou une spécialiste en environnement et ADNe.

La conservation de l’échantillon d’ADNe est importante pour assurer la réussite des analyses en laboratoire. En général, les échantillons d’eau doivent être filtrés, conservés et entreposés dans de l’éthanol de qualité moléculaire de 95 à 100 % ou dans de la silice dans les 24 heures suivant l’échantillonnage (et avant d’être soumis au laboratoire). Une fois les échantillons conservés et entreposés, les filtres d’ADN devraient restés viables pendant six mois ou plus longtemps s’ils sont entreposés dans des congélateurs sans dégivrage automatique à - 20 °C ou moins. L’ADNe extrait en laboratoire (dans une solution tampon) est très stable et demeurera viable pendant des années dans ces mêmes conditions d’entreposage (dans un congélateur).

Éléments à prendre en compte pour les analyses d’ADN environnemental

Pour assurer l’efficacité de l’analyse d’ADNe, il faut tenir compte des éléments qui suivent :

Plan d’échantillonnage sur le terrain

  • Le meilleur moment pour échantillonner
  • Le meilleur endroit où échantillonner
  • La quantité d’échantillons, dans le temps et dans l’espace

Filtration et conservation des échantillons

  • Les échantillons d’eau doivent être filtrés le plus rapidement possible, soit les 24 heures suivant le prélèvement.
  • Le filtre (l’échantillon) doit être conservé dans de l’éthanol de qualité moléculaire de 95 à 100 % ou de la silice immédiatement après la filtration.

Analyse d’ADNe

  • À des fins de spécificité, la validation des essais d’ADNe doit permettre de vérifier que seules les espèces cibles ont été détectées.
  • Le protocole de laboratoire comprend des mécanismes de surveillance de la dégradation de l’ADN et de l’inhibition du test.
  • La quantité de réplicats dans le laboratoire augmente la puissance statistique (Bureau Veritas teste huit réplicats par échantillon).

Analyses d’ADN environnemental offertes

Les analyses d’ADNe offertes sont présentées au tableau 1. Elles ciblent toutes une espèce en particulier, sauf le test eFish. Ce dernier est général et il permet d’identifier l’ADNe de 12 espèces de poisson, mais ne permet pas de différencier ces espèces entre elles.

Tableau 1 : Analyses d’ADNe offertes

  TESTS D’ADNe ESPÈCE NOM COMMUN
Grenouilles RAAU Rana aurora Grenouille à pattes rouges
Grenouilles ASMO Ascaphus montanus Grenouille à queue des Rocheuses
Grenouilles LICA Lithobates (Rana) catesbeiana Ouaouaron de l’Amérique du Nord
Grenouilles ANBO Anaxyrus (Bufo) boreas Crapaud de l’Ouest
Grenouilles RAPR Rana pretiosa Grenouille maculée de l’Oregon
Grenouilles ASTR Ascaphus truei Pacific (Coastal) tailed frog
Poissons ONTS Oncorhynchus tshawytscha Saumon quinnat
Poissons ONKI Oncorhynchus kisutch Saumon coho
Poissons THAR Thymallus arcticus Ombre arctique
Poissons ONCL Oncorhynchus clarkii Truite fardée
Poissons ONMY Oncorhynchus mykiss Truite arc-en-ciel (steelhead)
Poissons ONNE Oncorhynchus nerka Saumon rouge
Poissons ESLU Esox lucius Brochet
Poissons MISA Micropterus salmoides Achigan à grande bouche
Poissons SACO Salvelinus confluentus Bull trout
eFish* Indiscriminately detects fish DNA    
Mammal SOBE Sorex bendirii Musaraigne de Bendire
Reptile GLIN Glyptemys insculpta Wood turtle
Salamander AMMV (AMTI) Ambystoma mavortium Salamandre tigrée de l’Ouest
Salamander AMMV (AMTI) Ambystoma tigrinum Salamandre tigrée

*eFish detects DNA indiscriminately from fish species. Validated species detected: Sockeye salmon, Pink salmon, Chum salmon, Arctic grayling, Cutthroat trout, Rainbow trout, Chinook salmon, Coho salmon, Atlantic salmon, Dolly varden, Round whitefish, Slimy sculpin, American eel, Northern pike, Largemouth bass, Smallmouth bass, Bull trout and Eulachon.

Élaboration de méthodes d’analyse de l’ADN environnemental

À ce jour, l’approche de Bureau Veritas concernant le développement de méthodes d’essais pour l’ADNe à des fins commerciales est de valider, à l’interne, des méthodes déjà publiées. Ainsi, les essais sont transférables pour les échantillons contrôlés en laboratoire ou qui proviennent du site pour deux paramètres fondamentaux : la sensibilité (des critères de détection fiables) et la spécificité (aucune réaction croisée, surtout pour les espèces apparentées ou sympatriques). Grâce aux commentaires des clients, Bureau Veritas continuera d’élargir la gamme de méthodes d’essais commerciaux d’ADNe telles que présentées au tableau 1.

Il convient toutefois de noter que l’approche ci-dessus laisse une question importante sans réponse : que faire pour les espèces cibles pour lesquelles aucun test d’ADNe n’a encore été mis au point à ce jour ?

La disponibilité future de données sur les séquences d’ADN pour d’autres espèces permettra sans aucun doute de concevoir des amorces et des sondes. L’accessibilité à des échantillons de tissus (ou ADN génomique) des espèces cibles (et des espèces apparentées ou sympatriques) est une condition préalable à la conception d’un plan d’expérimen-tation. Cette condition pose problème lorsque la population des espèces cibles est en faible quantité, rare ou en voie de disparition et que leur échantillonnage pourrait donc être interdit. Bureau Veritas compte conclure des ententes collaboratives avec des tierces parties qui faciliteraient le développement de nouveaux tests d’ADNe pour les espèces cibles d’intérêt.

Limites des analyses d’ADNe

Les limites des tests d’ADNe doivent être prises en considération lors de la conception d’études sur le terrain et de l’interprétation des résultats en laboratoire :

  • Les résultats sont binaires ; l’analyse d’ADNe donne un résultat « détecté » ou « non détecté ». Les résultats ne peuvent être extrapolés pour déterminer l’abondance ou la densité des espèces cibles.
  • Les renseignements géographiques sont limités; Puisque l’ADN est transporté dans les milieux aquatiques, il est impossible d’en extraire des données exactes sur la localisation ou la proximité de l’organisme ou encore sur la durée de sa présence dans l’environnement.
  • L’ADNe ne permet pas de confirmer la présence d’un organisme vivant ou mort, mais plutôt de détecter des signes de présence des espèces cibles.
  • La source précise de l’ADN sur l’organisme (p. ex. les gamètes ou la peau) n’est pas révélée par l’ADNe.
  • Les résultats sont limités à « détecté » et « non détecté ». L’âge, le sexe, la grosseur et l’état reproducteur des organismes par exemple ne sont pas détectés.
  • Les tests d’ADNe sont influencés par les variations du milieu qui affectent le transport de l’ADN (comme le débit de l’eau) et sa stabilité (température de l’eau, pH, salinité, exposition aux microorganismes, à la lumière ultraviolette qui dégradent l’ADN). En général, l’ADNe peut être détecté de 7 à 21 jours après son rejet dans l’environnement.

Et maintenant ?

L’analyse de l’ADNe devient une technique fiable et solide qui s’ajoute aux autres méthodes de surveillance traditionnelles de l’environnement. Il est important de noter que les techniques traditionnelles offrent encore des avantages sélectifs par rapport à celle de l’ADNe, dont la possibilité de faire la distinction entre plusieurs espèces vivantes et les différentes étapes du cycle de vie de ces dernières.

De plus, les normes d’analyse de l’ADNe pour les laboratoires ne sont pas encore établies et elles doivent être soigneusement étudiées pour que cette technique en constante évolution puisse être utilisée au maximum de sa capacité.

Bureau Veritas s’engage à travailler étroitement avec les experts et expertes en analyse d’ADNe pour élaborer des normes qui sont à la fois appropriées et acceptées puisqu’elles deviendront la pierre angulaire de la qualité des résultats et de son acceptation générale.

Bureau Veritas est fier d’être le premier laboratoire canadien en analyse de l’ADNe à recevoir une certification ISO/CEI 17025 par le Conseil canadien des normes. Nous nous engageons à travailler étroitement avec les experts et expertes en analyse d’ADNe pour élaborer des normes par processus consensuel qui permettront une meilleure interprétation des résultats.

Références

[1] Veldhoen N, Hobbs J, Ikonomou G, Hii M, Lesperance M. et Helbing CC. Implementation of Novel Design Features for qPCR-Based eDNA Assessment. PLoS One, 2016, 11 :11, e0164907. Publié le 1er novembre 2016 DOI:10.1371/journal.pone.0164907

[2] Jared Hobbs et Caren Goldberg. Environmental DNA Protocol for Freshwater Aquatic Ecosystems (version 2.2), préparé pour : le ministère de l’Environnement de la Colombie-Britannique, novembre 2017.