Laboratoire

Détection et quantification du SARS-CoV-2 dans les échantillons deaux usées

mar. 23 2021

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) est un agent pathogène d’origine animale qui est composé de :

  1. Une capsule externe, et
  2. Un seul brin d’acide ribonucléique (ARN) enveloppé dans une structure protéique appelée nucléocapside.

La détection de ce virus nécessite de cibler les biomarqueurs spécifiques du SARS-CoV-2, donc les gènes spécifiques codant ses caractéristiques structurelles. Les biomarqueurs les plus courants pour le virus SARS-CoV-2 sont les gènes N1 et N2 codant la protéine de la nucléocapside (à ne pas confondre avec la capsule elle-même).

La méthode d’analyse des eaux usées est très similaire aux tests cliniques individuels. Toutefois, en plus de confirmer la présence ou l’absence des biomarqueurs viraux, cette méthode quantifie également le nombre de copies des gènes par unité de volume. À Bureau Veritas, l’analyse et la quantification sont réalisées par la méthode quantitative de réaction en chaîne par polymérase avec transcriptase inverse (RT-qPCR).

PRÉLÈVEMENT ET TRAITEMENT DES ÉCHANTILLONS

D’après les données tirées des études portant sur l’épidémiologie des eaux usées pour le SARS-CoV-2, la forme la plus représentative d’échantillonnage d’un affluent des eaux usées est un composite, pondéré en fonction du temps ou du débit. Des échantillons prélevés au hasard peuvent également être utilisés, mais une bonne compréhension de la taille de la population et de l’influence temporelle est nécessaire. Les échantillons prélevés doivent être immédiatement placés sur de la glace avant d’être envoyés au laboratoire. Le matériel génétique ARN est beaucoup plus sujet à la dégradation que l’ADN car il s’agit d’une structure à brin unique. De plus, la matrice des eaux usées contient d’autres agents chimiques potentiels qui peuvent dégrader davantage l’ARN viral cible. Bien que l’on ne soit pas parvenu à un consensus sur la question de savoir si le virus du SARS-CoV-2 est encore actif au moment de la collecte de l’affluent, on soupçonne qu’une grande partie de sa capsule est déjà dégradée. Des études ont indiqué une inactivation complète dans les eaux usées entre 2 et 4 jours après la collecte.

La méthode de Bureau Veritas pour l’analyse RT-qPCR de l’ARN du SARS-CoV-2 nécessite un contenant de 250 mL fourni par le laboratoire (stérile et sans RNAse). Une aliquote de 40 mL est prélevée par échantillon pour le traitement, l’extraction et l’analyse. Deux autres aliquotes de 40 mL sont stockées temporairement pour une éventuelle ré-analyse (si nécessaire), l’une à 4 °C et l’autre à -80 °C. Bien qu’il n’existe pas encore de méthode de référence, les meilleures pratiques recommandent d’extraire les échantillons dans un délai maximum de 48 heures après leur prélèvement. Une fois les échantillons extraits, les flacons peuvent être congelés pendant une courte période, ce qui évite la perte de matériel ARN.

Les données accumulées jusqu’à présent sur l’analyse du SARS-CoV-2 dans les échantillons d’eaux usées suggèrent que le virus est hydrophobe et se sépare bien des solides. La méthode d’analyse de Bureau Veritas utilise la précipitation au polyéthylène glycol (PEG) et la centrifugation réfrigérée pour séparer les solides au cours de l’étape de préparation des échantillons.

ANALYSE DES ÉCHANTILLONS ET RAPPORT

Les échantillons préparés subissent une extraction de l’ARN, suivie d’une analyse RT-qPCR en une étape. L’analyse par PCR quantitative nécessite du matériel génétique double brin. L’ARN extrait doit donc d’abord être converti en ADN complémentaire (ADNc) par l’enzyme de type transcriptase inverse (RT). Ensuite, le processus de qPCR amplifie les gènes cibles et quantifie les copies en temps réel. Toute la procédure est réalisée à l’aide d’un seul mélange, d’où l’appellation « en 1 étape ».

Les gènes biomarqueurs cibles du SARS-CoV-2, le N1 et le N2, sont identifiés et quantifiés pour chaque échantillon. De plus, pour rapporter ces résultats quantitatifs par rapport à la quantité de matières fécales capturées par l’échantillon, le virus de la marbrure légère du piment (PMMoV) est également quantifié. Un contrôle positif interne est également utilisé pour évaluer l’inhibition de la qPCR. Un échantillon inhibé passe par un processus de nettoyage supplémentaire avant l’analyse par RT-qPCR en 1 étape (N1, N2, PMMoV).

Les résultats analytiques fourniront :

  1. Indication de la présence ou de l’absence de biomarqueurs du SARS-CoV-2
  2. Quantification des copies du gène SARS-CoV-2 / mL (total des N1 et N2) ;
  3. Copies normalisées du gène SARS-CoV-2 / mL (par rapport au PMMoV), et
  4. État d’inhibition de l’échantillon.